斑馬魚小兒腫瘤模型

2、Myc驅動的T-ALL斑馬魚模型: 

第一個轉基因斑馬魚腫瘤模型是應用rag2啟動子驅動小鼠原癌基因Myc在T和B淋巴細胞中的表達的T-ALL模型。在Tg(rag2:mMyc)轉基因模型中，Myc嵌合體表達誘導6%的動物出現T-ALL，平均潛伏期為44天。

 

由Myc驅動的T-ALL條件種系斑馬魚模型現已通過以下三種方法之一建立：

(i)將Cre mRNA注射到Tg(rag2-lox-dsRED-lox-EGFP-mMyc)斑馬魚胚胎；

(ii)讓Tg(rag2:LDL-EGFP-mMyc) 和Tg(hsp70:Cre) 品系斑馬魚雜交；

(iii)用4-羥基他莫昔芬處理Tg(rag2:hMYC-ER)品系斑馬魚。

正如后面詳述的，在這些精準模型中重現性和腫瘤分生率的提升（到生命第35天，腫瘤發生率達80%-100%），使得促進或抑制Myc-驅動T-ALL發病，發展和生存的新基因和/或遺傳途徑，以及可抑制體內腫瘤發生的藥物的發現成為可能。

 

3、Notch驅動的T-ALL斑馬魚模型: 

在超過60％的T-ALL病例中，NOTCH信號通路被異常激活，并能通過MYC依賴和非依賴通路促進T-ALL腫瘤的發生。

 

此外，NOTCH1和Myc在斑馬魚T-ALL發病過程中協同工作，因為與單獨Myc或NICD的表達相比，rag2介導的Myc和NOTCH1的組成型活性細胞內結構域（NICD）的表達加快了T-ALL的進程。

 

增強的Notch信號傳導不會增加白血病增殖細胞的數量，這表明NOTCH控制著癌前細胞的擴增，而Myc主要驅動克隆細胞的生長和存活。在約16％的復發性兒科T-ALL病例中，Notch通路突變也與Hedgehog通路的激活有關。ptch1（Hedgehog信號通路的負調節因子）的丟失加速了斑馬魚中notch1誘導的T-ALL的發作，這表明Hedgehog信號通路的激活與NOTCH1協同驅動T細胞轉化。

 

4、確定T-ALL腫瘤發生的新遺傳機制: 

斑馬魚已被用于發現通過不同機制驅動T-ALL發病機理的新致癌輔因子。例如，發現胸腺選擇HMG蛋白（TOX）與Myc以及NICD協同作用，通過受損的非同源末端連接DNA修復誘導基因組不穩定，從而促進斑馬魚的T-ALL進展。

 

ARID家族基因的表達升高會導致T-ALL腫瘤的myc水平升高，這表明ARID5B有助于T-ALL腫瘤發生過程中Myc的過表達。JDP2編碼bZIP蛋白，其異常的淋巴細胞特異性表達與小兒T-ALL病例的整體生存期差有關，足以誘發超過50％的斑馬魚在受精后40周（wpf）患上T-ALL，并且與Myc共表達時能引起更高的腫瘤風險。因此，這些研究揭示了有可能靶向地使MYC驅動的T-ALL腫瘤失效的新機制的存在。

 

5、使用斑馬魚確定T-ALL的新療法: 

小兒白血病患者有>90％的存活機率。然而，當前的治療方案會引起全身毒性，并且一部分患者最終會復發。

 

為了確定可能解決該問題的新型T-ALL治療方法，使用T-ALL模型Tg（rag2：MYC-ER）品系斑馬魚對4880種FDA批準的化合物進行了小分子篩選。

 

斑馬魚胚胎實驗發現，吩噻嗪類抗精神病藥奮乃靜可降低胸腺熒光，減輕MYC誘導的T-ALL斑馬魚的腫瘤總負荷，以及抑制鼠異種移植模型中人T-ALL細胞的生長。

 

在Myc; Akt驅動的T-ALL中，糖皮質激素地塞米松和AKT抑制劑（MK2206）的組合對抑制白血病增殖細胞非常有效。使用連續移植的方式，發現MK2206克服了地塞米松的耐藥性，這一發現在人T-ALL細胞中得到了重現。MK2206進入了兒童難治性惡性腫瘤的I期臨床試驗，并且在測試劑量下耐受性良好，但迄今為止僅觀察到有限的獲益。

 

在斑馬魚Myc驅動的T-ALL模型中，發現jdp2的表達賦予地塞米松耐藥性。斑馬魚數據表明，對AKT途徑活化和/或JDP2升高的患者分層可能有助于預測對涉及糖皮質激素治療的反應。
 

6、急性B淋巴細胞白血?。˙-ALL）: 

B-ALL占所有兒童期ALL病例的85％。B-ALL和T-ALL在形態上是無法區分的，兩種疾病的特征在于擁有不同的分子亞型。

 

盡管頻率不同，成人和小兒B-ALL均存在相似的遺傳和染色體異常，包括BCR-ABL1和ETV6-RUNX等融合基因，MLL重排，超倍性和亞倍性。

 

斑馬魚中的第一個B-ALL模型使用非洲爪蟾伸長因子1α和斑馬魚β-肌動蛋白啟動子普遍表達TEL-AML1（ETV6-RUNX），以誘導3％的B-ALL腫瘤發生率。

 

此外，最近發現，Tg（rag2：hMYC）品系的一部分斑馬魚也患有B-ALL腫瘤，具有與T-ALL腫瘤不同的基因表達譜，表明該轉基因品系實際上是混合型急性淋巴細胞白血病模型。這些研究強調需要結合現代比較腫瘤基因組學方法來驗證正在建模的斑馬魚品系對應的人類腫瘤的確切類型和/或亞型。

 

7、急性髓系白血?。ˋML）斑馬魚模型: 

AML的定義是，未成熟的骨髓細胞占據患者至少20％的骨髓。AML的整體5年生存率是64％，但不同分子亞型的患者，其生存率差異顯著。

 

與其他惡性液體腫瘤不同，一些兒童AML患者的體細胞變異與成人AML中觀察到的顯著不同。兒童AML以AML1-ETO（也稱為RUNX1-RUNX1T1），NUP98-NSD1和KMT2A-MLLT3等基因融合事件為唯一特征。

 

hsp70啟動子驅動的AML1-ETO的表達，CMV啟動子驅動的FLT3-ITD或FLT3-TKD的表達，導致早期斑馬魚胚胎中的髓樣細胞擴增。使用COX2抑制劑尼美舒利阻止β-連環蛋白介導的骨髓生成，可以逆轉AML1-ETO胚胎的造血缺陷。

 

此外，通過使用酪氨酸激酶抑制劑（AC220）可以消除FLT3-ITD動物的髓樣擴增，而FLT3-TKD動物則不能，這表明看似相似的遺傳異常存在不同的治療機率。這些研究說明了斑馬魚胚胎在了解造血過程中致癌融合基因的基本機制以及發現小兒白血病新療法方面的實用性。
 

四、斑馬魚模型在腦和中樞神經系統腫瘤研究中的應用

腦和中樞神經系統腫瘤是小兒癌癥相關死亡的主要原因。大約75％的小兒腦腫瘤是惡性的，其5年總生存率達78％。

 

此外，腫瘤的外科手術減瘤，放療和常規化療會給發育中的大腦帶來長期并發癥。幸運的是，小兒腦腫瘤的基因組表征方面的重大進展已經確定了具有不同分子譜的特定腦腫瘤，從而可以對具有復發性基因組特征的腫瘤進行更準確的分類。而現在的挑戰是為基因和藥物發現開發基于細胞和動物的新的腦腫瘤模型。

 

1、中樞神經系統原始神經外胚層腫瘤（PNETs）的模型: 

CNS-PNETs通常出現在大腦中，占小兒腦腫瘤的3–5％。CNS-PNET的一個亞群稱為CNS NB-FOXR2，它表達對少突膠質前體細胞（OPC）和RAS / MAPK途徑活化至關重要的轉錄因子。

 

為了對此亞組進行建模，我們在表達sox10的OPC中激活了NRAS信號傳導，該信號以6 wpf的頻率啟動了腦腫瘤的形成，表明OPC是這些腫瘤的起源細胞，而且可以通過激活的RAS / MAPK信號傳導進行轉化。

 

組織學和跨物種的基因組分析表明，與任何其他CNS-PNET亞型甚至正常的斑馬魚腦相比，斑馬魚腦腫瘤與人CNS NB-FOXR2腫瘤的相似性更高令人驚訝的是，斑馬魚CNS NB-FOXR2腫瘤對MEK抑制劑（AZD6244）的治療選擇性敏感，表現為腫瘤負荷顯著減少，總生存期增加。AZD6244目前正處于治療小兒腦腫瘤的臨床試驗中，可以有效地用于治療CNS NB-FOXR2患者。

 

這些研究表明，斑馬魚能如何被用于快速測試細胞遺傳學起源和通路激活預測，這些預測源于目前針對小兒腦腫瘤實體（包括罕見亞組）靶向療法開發的最新基因組數據。

 

斑馬魚似乎是用于檢測OPC衍生的兒科腫瘤的遺傳驅動力的優秀動物模型。例如，斑馬魚中nfla / b或rb 1腫瘤抑制基因的丟失（通常為p53缺陷）會產生類似于少突膠質細胞瘤的腦腫瘤或類似于CNS-PNETs的胚胎腫瘤。

 

這些研究表明，OPC衍生的兒科腫瘤獲得遺傳或表觀遺傳學變化，最終導致E2F轉錄因子家族激活，并且提示此類腫瘤對E2F抑制劑（例如HLM006474）敏感，而不考慮最初的致癌驅動因素。

 

2、神經母細胞瘤（NB）: 

NB是一種起源于神經衍生的周圍交感神經系統的實體瘤。它是嬰兒中最常見的非顱骨實體瘤，好發于腎上腺。NB患者的治療方法通常包括手術切除、化療、放療和骨髓移植。

 

目前，更好地了解高危NB的潛在機制很有必要，因為這些患者的5年生存率僅為50％。斑馬魚系統對于發現新的致癌驅動因素，聯合基因突變和促進高風險NB的發育轉錄網絡以及新的治療模式具有極其重要的價值。

 

3、神經母細胞瘤的斑馬魚模型: 

在約20%的NB患者中觀察到MYCN基因的擴增，其與預后不良有關。NB的斑馬魚模型是通過使用多巴胺-β-羥化酶（dβh）啟動子將人MYCN基因靶向表達到發育中的周圍交感神經系統來驅動的。低（17％）和高（70％）風險的NB斑馬魚模型已建立，以分別用于檢測可增加或減少腫瘤負荷的協同突變。低風險NB模型Tg（dβh：EGFP-MYCN）表達EGFP-MYCN融合蛋白，而高風險Tg（dβh：EGFP;dβh：MYCN）模型涉及EGFP和MYCN基因的共整合而不是融合。在這兩種模型中，斑馬魚NB腫瘤在組織學上都與人NB類似，并且主要在腎間腺（斑馬魚與人腎上腺髓質等同的部位）中出現。

 

低風險Tg（dAh：EGFP-MYC）NB模型已用于鑒定與MYCN協同促進NB腫瘤發生的許多基因。例如，MYCN擴增的患者經常存在RAS信號通路的修飾，包括ALK，NF1和PTPN11的突變。MYCN與ALKF1174L，PTPN11E69K的共表達或nf1的缺失減少了腫瘤發作的潛伏期并增加了得腫瘤的風險。這些研究表明，RAS通路的激活是引起體內發生侵襲性NB的重要事件，并且RAS通路抑制劑可能能夠有效減緩或預防MYCN擴增的NB的疾病進展。重要的是，目前正在評估ALK抑制劑在高危NB中的臨床療效。

 

高風險的NB患者經常表現出較廣泛的基因組重排，包括染色體的獲得和缺失。因此，斑馬魚NB模型已用于篩選存在于染色體失衡區域的潛在惡性腫瘤相關基因。在斑馬魚NB模型Tg(dβh:EGFP-MYCN)品系中，測試了代表了高危NB病例中典型的染色體獲得的位于1q號染色體上的候選基因能否改變腫瘤發生的風險，并且消化器官擴增的能力因子（DEF）基因被鑒定為NB在體內的協同驅動子。

 

此外，def單倍劑量不足可通過誘導細胞凋亡顯著降低高風險Tg（dβh：EGFP;dβh：MYCN）品系以及人NB細胞系中的腫瘤生長。因此，DEF可能成為具有1q染色體獲得的NB患者新的治療靶點。

 

大約50％的高危NB病例沒有MYCN擴增，因此其他遺傳或流行病事件可能導致了這些高度惡性的癌癥。例如，最近的一項研究表明，MYMY的同系物cMYC可以誘導斑馬魚的侵襲性NB。這是第一個提供人類細胞和患者樣本數據的動物模型，該模型顯示10％的不依賴MYCN的高風險NBs通過8q24易位的遠距離增強子或增強子劫持而引起cMYC mRNA和蛋白水平異常表達。因此，現在可以根據MYCN與cMYC蛋白的表達對高危NB患者進行分層，以最終實現精準醫療。

 

NB的一項重大臨床挑戰是轉移的治療，這在NB診斷時經常出現。全基因組關聯研究確定LIM-only結構域基因（LMO1）與高度轉移性NB腫瘤密切相關。LMO1與MYCN的共表達僅輕微改變腫瘤風險和發病，但會顯著增加NB轉移的發生。LMO1的過表達還增強了人NB細胞的遷移能力，并上調了參與細胞外基質重塑的基因。這些研究為快速發現能影響體內NB轉移的其他遺傳事件和/或藥物鋪平了道路。
 

五、斑馬魚模型在肉瘤研究中的應用

軟組織和骨肉瘤占所有兒童期癌癥的7％。兒童和青少年中最常見的肉瘤是橫紋肌肉瘤（RMS）。

 

它由未分化的肌肉細胞形成，通常出現在頭/頸部，泌尿生殖道或四肢。橫紋肌肉瘤有兩種主要的組織學亞型，胚胎型（ERMS）和肺泡型（ARMS）。

 

ERMS占所有RMS病例的75％，通常特征在于11p15.5位點或MYOD1，FGFR4以及編碼主要RAS GTPases的任何基因的點突變處的11p15.5基因座雜合性喪失。

 

相比之下，80％的ARMS患者表現出PAX3-FOXO1或PAX7-FOXO1融合基因的過表達。在過去的50年中，RMS治療在很大程度上保持不變，僅限于局部切除，放射治療和多藥化療，盡管二代測序和患者分子分型取得了進展，但ERMS患者的5年生存率保持在82％，ARMS患者保持在65％。如稍后所述，斑馬魚RMS模型為我們對這些小兒癌癥的病因學的理解做出了重要貢獻。

1、融合陰性RMS的斑馬魚模型: 

斑馬魚ERMS研究最多的模型是使用rag2啟動子驅動組成型活性KRAS（KRASG120）基因的表達而建立的。在該模型中，KRASG120以散在的形式在肌衛星細胞中異常表達（因為非淋巴細胞中rag2啟動子片段的異常激活）。這些魚中近50％會迅速（受精后10-80天）發展出腫瘤。使用人類RMS的臨床標記物的RNA原位雜交以及基因集富集分析研究證實，斑馬魚腫瘤的基因組與人類ERMS極為相似。這些研究表明，肌衛星細胞至少是ERMS起源細胞之一。

 

腫瘤復發是有效治療ERMS的重大臨床挑戰。斑馬魚ERMS模型已被用于識別在ERMS發病過程中可能影響腫瘤繁殖細胞（TPC）行為的潛在基因。Tg（rag2：KRASG12D）斑馬魚ERMS驅動因子與先前確定的對肌肉再生和干細胞自我更新很關鍵的基因共表達，包括rag2-ICN1（斑馬魚胞內激活的NOTCH1），rag2-Vangl2或mylpfa-myf5。重要的是，控制ERMS中TPC的遺傳機制在小鼠RMS異種移植的人類細胞以及體外成球試驗中均是保守的。因此，ERMS的斑馬魚模型在發現新的，保守的腫瘤復發和ERMS自我更新機制中發揮了作用，現在可以在臨床前試驗中探索這種機制，以改善患有復發或轉移性疾病的兒童的生存率。

 

斑馬魚Tg（rag2：KRASG120）模型已用作臨床前模型，用于測試在ERMS腫瘤生長過程中抑制KRAS信號傳導的藥物的功效。下游KRAS效應物（如MEK（PD98059）和S6K1（TPCK））的協同藥理失活作用，表明對MAPK和AKT途徑的雙重抑制可能是KRAS驅動的ERMS的有效靶向療法。

 

此外，在斑馬魚和人類RMS細胞中，抑制RAS和mTOR通路均會抑制翻譯起始，為有生長抑制作用的藥物在ERMS中應用提供了機制基礎。相似的研究發現，VEGFA抑制劑（西地尼布）可將ERMS腫瘤的生長降低三倍，并降低微血管的密度，這表明VEGFA信號可能通過促血管生成促進ERMS腫瘤的進展。

 

此外，GSK3（6-溴吲哚賓-3'-肟）和HDAC（曲古抑菌素A或伏立諾他）的抑制劑可阻止ERMS腫瘤的生長。重要的是，所有這些研究都利用了基于人類RMS細胞的模型來揭示藥物對細胞生長/增殖，分化和遷移的影響，從而為這些藥物的臨床療效突顯提供可能性。

 

2、融合陽性RMS的斑馬魚模型: 

近期，通過使用CMV啟動子普遍表達人PAX3-FOXO1融合基因的方式建立了一個新的斑馬魚ARMS模型。

 

與ERMS模型相比，ARMS的起源是未知的。盡管如此，這些研究表明，PAX3-FOXO1人融合癌基因足以將斑馬魚細胞轉化為具有獨特組織學特征的ARMS腫瘤或CNS-PNETs。PAX3–FOXO1導致轉錄因子hes3在肌肉細胞中異常表達，從而阻斷了肌肉分化標志物的表達。

 

同樣地，人HES3在斑馬魚和肌肉祖細胞中的表達抑制肌生成，而人RMS患者中HES3的表達增加會導致預后不良。因此，這種斑馬魚模型為保守的遺傳機制研究（PAX3–FOXO1融合基因介導腫瘤發生）提供了重要的見解。實際上，融合陽性肉瘤研究的一項重要進展是能夠使用斑馬魚模型在無需事先了解起源細胞的情況下，快速檢測融合癌蛋白的轉化潛力。

六、結論

與成人癌癥相比，小兒癌癥很罕見。因此，許多兒科腫瘤都沒有相關的基于細胞系或動物的模型來定義疾病發病機理或測試潛在的治療方法。臨床前藥物研究一般來說需要用昂貴且耗時的嚙齒動物模型來評估新療法的療效，并且由于財務方面收益有限，較小眾的兒科癌癥領域通常激不起業界開發新療法的興趣。

 

因此，我們認為，斑馬魚模型對小兒癌癥研究的最關鍵的好處是能夠以及時且負擔得起的方式開發稀有腫瘤亞型模型（如先前針對白血病、腦瘤、NB和肉瘤的描述）以進行臨床前藥物發現。

 

此外，斑馬魚獨特的成像屬性是一個強大的工具，可以直接監測侵襲和轉移過程中腫瘤細胞的行為以及對藥物治療的反應。這些屬性對于研究成人癌癥同樣重要，并且最近已在其他地方進行了評論。這些特征以及斑馬魚和鼠模型在兒科腫瘤研究中的不同優勢的比較如圖2所示。

 

斑馬魚兒科腫瘤模型仍然需要解決許多懸而未決的挑戰。使用特定的啟動子元件或CRISPR / Cas9介導的敲入等位基因完善一些現有的斑馬魚模型，有望大大推動該領域的發展。借助最近的癌基因組分析和細胞起源特異性啟動子的使用，還可以在斑馬魚中建立主要類別的小兒腫瘤新模型，包括髓母細胞瘤，視網膜母細胞瘤，Wilms腫瘤，甲狀腺癌和癌癥易感綜合癥（Box1）。

 

 

此外，斑馬魚患者異種移植（PDX）模型（Box2）有望加速新療法的鑒定。因此，斑馬魚兒科腫瘤研究領域有望滿足目前對兒童癌癥的許多需求，尤其是在使用基于精確醫學的方法治療罕見腫瘤方面的應用。
 

Box 1. 腫瘤易感綜合征:

大約10％的兒童和青少年癌癥是由癌癥易感基因（例如P53，NF1，RB1和APC）的突變引起的。常見的癌癥易感性疾病包括神經纖維瘤病、Noonan綜合征、Costello綜合征、視網膜母細胞瘤、Down綜合征、Gorlin綜合征和Li-Fraumeni綜合征。

 

一些突變引起特定類型的腫瘤（例如RB1突變和成視網膜細胞瘤），而另一些則使患者易患多種不同的癌癥類型（例如與Li-Fraumeni綜合征相關的P53突變）。癌癥易感綜合癥通常與多種癌癥的診斷，典型的成人特異性癌癥的兒童期發作，先天性異常并發以及某些腫瘤的發展有關。

 

然而，從認識最初的驅動突變因子到獲得診斷疾病的能力，我們對癌癥發展過程中小兒癌癥易感性綜合征的發生機制的理解上仍然存在相當大的差距。先前使用Tol2介導的基因陷阱引入組合型活性HRASV12-GFP來在斑馬魚中模擬Costello綜合征的工作促進了與Costello綜合征相關的一些特征的發展，例如體長較短，顱面缺陷者以及有RMS傾向（盡管概率很低）。

 

此外，還開發了帶有p53缺失突變體的Li-Fraumeni綜合征模型，該突變體自發地發展為血管肉瘤，生殖細胞腫瘤，白血病和惡性周圍神經鞘瘤。然而，該領域最終需等待其他基因組學研究和針對其他癌癥易位綜合征的其他動物模型的開發，然后才能朝著發現有效治療方案的方向進一步發展。

 

Box 2. 小兒癌移植模型：

PDX模型是評估新的抗癌療法和通過移植原發性患者腫瘤聯合精準醫療的重要工具。對于這些研究而言，通常免疫缺陷小鼠需要植入移植物2–8個月才能開始評估治療方案。

 

斑馬魚的幼魚也被用于建立腫瘤異種移植模型，因為其免疫系統要到4周齡才能完全成熟。斑馬魚胚胎和幼魚移植能夠在短短的10天之內進行高通量藥物篩選并直接腫瘤細胞的行為是可視化的。

 

但是，幼魚生長所需的適應性免疫系統和較低的溫度（28–35℃）最終會殺死人類細胞。該領域的一項令人振奮的進展是，建立了一種透明的prkdc-/-;il2rga-/-斑馬魚品系，該品系斑馬魚缺少T，B和自然殺傷細胞，且能在37℃生長，可以長期穩定地建立與免疫缺陷小鼠PDX模型有相同的腫瘤生長，增殖和存活動力學的人類PDX模型。由于該研究可以在28天內完成，因此可以進行實時治療評估，這是精確醫學目前尚不具備的重要功能。

 

然而，免疫功能低下的模型仍然不是理想的，因為許多癌癥患者在治療前保留了功能性免疫系統。然而，人源化PDX模型的開發（其中動物同時植入了人類造血干細胞和PDX），使得能夠在部分免疫應答的情況下評估腫瘤動力學，并能夠測試相關的抗癌免疫療法的功效。通過將人類免疫祖細胞與患者腫瘤共移植并產生針對人類細胞生長而優化的轉基因斑馬魚品系，包括人生長因子（例如IL-3和GM-CSF）的表達，這種迅速發展的領域有望在不久的將來在斑馬魚中成為可行。

 

 

參考資料：

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